酵母转化和克隆

酿酒酵母是一种常用于遗传学和细胞生物学研究的简单真核模式生物，可以深入了解人类细胞过程。

这是主要记录：酵母细胞吸收外源 DNA

质粒：是由环状超螺旋DNA组成的小分子酵母菌酿酒原理，因此很容易通过细胞膜上的膜孔。

1. 酵母载体

穿梭载体：指能在多种不同宿主物种中复制的载体，如既能在大肠杆菌中复制又能在酵母中复制的载体。

1.1 酵母载体类型

酵母载体可以是非整合或整合载体。 质粒可以整合到基因组 DNA 中，也可以独立存在。

载体类型

1.2 常用的酵母载体

酵母中常用的质粒或载体有五种类型。 最常用的酵母细胞是酵母附加型质粒 YEp 和酵母着丝粒质粒 YCp。

酵母载体

两种质粒都包含一个自发复制序列 ARS，它包含一个复制起点，使其能够独立于酵母中的染色体进行复制。

穿梭质粒

二、酵母转化法原理

目前用于酵母转化的方法有几种：原生质体法、电穿孔法和醋酸锂法，这里只介绍醋酸锂法。

醋酸锂法是利用带正电的锂离子中和细胞壁和质粒上的负电荷，转化液中的单链DNA会与细胞壁结合，这样只有质粒DNA才能被吸收酵母细胞。

质粒DNA

然后，利用突然升高的温度，使细胞内外产生压力差，在细胞壁上形成一个小孔，使质粒进入。 一旦温度降下来，酵母细胞壁恢复，转化就完成了。

细胞壁形成孔

3. 酵母转化实验步骤 3.1 准备感受态酵母细胞

首先从琼脂平板上挑取酵母细胞，然后使用酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖培养基 (YPD) 扩大菌落，YPD 是酵母生长的完全培养基。 在 30°C 的振荡器或旋转器中孵育过夜。

离心酵母细胞，弃上清，保留沉淀，然后用相应的缓冲液或蒸馏水重悬。 如此制备的感受态细胞将用于转化。

3.2 准备“转换组合”

按照下图比例准备好“转化组合”。 试剂配好后，置于30摄氏度的摇床上摇晃30分钟（混匀即可，不要剧烈摇晃，以免酵母细胞破裂）

转换组合

将细胞在42℃水浴中热激15分钟酵母菌酿酒原理，然后在冰上冷却2分钟，并通过离心收集。 将细胞重悬于双蒸水中，并接种于含有相应载体抗性的选择性培养基上。 将转化的平板在 30°C 下孵育 2-4 天，直到出现菌落。

注意添加阳性和阴性对照：

4. 酵母转化的应用 4.1 酵母杂交（双杂交）

应用目的：鉴定与诱饵蛋白相互作用的蛋白。

用来自候选结合蛋白文库的质粒转化酵母细胞，如果它编码与诱饵蛋白相互作用的蛋白质，则释放转录因子激活报告基因，如 β-半乳糖苷酶。 在含有 β-半乳糖苷酶底物的平板上，报告基因将含有结合蛋白的阳性克隆变成蓝色。

酵母双杂交

4.2 多点删除模型

使用性循环技术在酵母中进行多次删除。 含有报告基因和缺失位点的单倍体细胞通过随机分配和减数分裂重组整合到一个细胞中。

单倍体重组

可以通过选择标记选择酵母细胞进行缺失。

含有缺失的酵母细胞

酵母也可以用荧光标记的蛋白质进行转化，以观察突变对蛋白质相互作用的影响。

例如：使用荧光显微镜研究不同突变对内吞作用所必需的蛋白质-蛋白质相互作用的影响。